همایش نوآوری در دانشگاه سه شنبه 9 اسفند تالار رازی با تلاش محققان ایرانی،موفقیت 70 درصدی در تشخیص عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C بدون نیاز به بیوپسی کبد امکان پذیر شد

دکتر فرح بخارائی سلیم، دکترای تخصصی ویروس شناسی و عضو گروه ویروس شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران (پردیس همت)، در گفتگو با خبرنگار روابط عمومی دانشکده پزشکی در رابطه با طرح خود گفت: ما بر روی حضور عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C در بیماران مبتلا به بیماری مزمن کبدی با علت ناشناخته برای اولین بار در ایران  مطالعه کردیم.
این متخصص ویروس شناس با بیان توضیحاتی راجع به هپاتیت یا التهاب کبدی و علت انجام این پروژه گفت: هپاتیت مزمن به گروهی از بیماریهای کبدی اطلاق می شود که علل و شدت متفاوت دارند و در آنها التهاب و نکروز کبدی حداقل برای شش ماه ادامه دارد که در اکثر موارد، با استفاده از اطلاعات بالینی، آزمایشات سرولوژیک، بیوشیمیایی و مولکولی، علت بیماری مزمن کبدی تشخیص داده می شود.
وی ادامه داد: در حدود 10 درصد از موارد، علت بیماری مزمن کبدی و افزایش سطح آنزیم های کبدی با اطلاعات بدست آمده تشخیص داده نمی شود که به این موارد بیماری مزمن کبدی با علت ناشناخته یا کریپتوژنیک اطلاق می شود. در بررسی های انجام شده مشخص شده است که شکلی از عفونت مزمن با ویروس هپاتیت C وجود دارد که در آن در سرم فرد مبتلا آنتی بادی و ژنوم ویروس هپاتیت C قابل شناسائی نیست در صورتیکه در کبد این بیماران ویروس هپاتیت C قابل ردیابی است.
دکتر بخارائی افزود: این نوع از عفونت را "عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C" می نامند که با روش های معمول آزمایشگاهی به علت عدم وجود شاخص های تشخیصی این ویروس در سرم، قابل شناسائی نیست.
ویروس هپاتیت C یک ویروس هپاتوتروپیک می باشد و در سلولهای کبدی تکثیر یافته و به آنها آسیب می رساند، ولی توالی ژنومی ویروس را می توان در مناطق خارج کبدی نیز یافت. از جمله این مناطق می توان به سلولهای تک هسته ای خون محیطی، سیستم اعصاب مرکزی، مغز استخوان، سلولهای پانکراس و غدد آدرنال بیماران مبتلا به عفونت هپاتیت C اشاره کرد. همچنین گزارش شده است که ویروس هپاتیت C را می توان در حدود 70-57 درصد موارد از سلولهای تک هسته ای خون محیطی افراد مبتلا به عفونت مخفی با این ویروس و در حدود 14 درصد موارد از خون تام این افراد جدا کرد.
این متخصص ویروس شناس با استناد به توضیحات فوق گفت: بنابراین با توجه به حضور ویروس در سلولهای تک هسته ای خون محیطی، می توان تعداد زیادی از افراد مبتلا به عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C را با جداسازی این سلولها از خون محیطی، و حداقل در بیش از نیمی از بیماران مبتلا به بیماری مزمن کبدی بدون نیاز به نمونه بیوپسی کبد شناسائی کرد.
وی خاطر نشان کرد: با توجه به اینکه در تمامی موارد ابتلاء به عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C، تشخیص عفونت با آزمایش روی سلولهای تک هسته ای خون محیطی میّسر نیست ، بنابراین استاندارد طلایی جهت تشخیص این عفونت، انجام آزمایش بر روی بیوپسی کبد بیماران است. البته در مواردی که انجام بیوپسی کبد برای بیماران امکان پذیر نباشد، آزمایش روی سلولهای تک هسته ای خون محیطی این بیماران می تواند بسیار ارزشمند باشد.
دکتر بخارائی با اشاره به نتایج تحقیقات انجام شده در دنیا گفت: مشخص شده که گاهی در سرم افراد مبتلا به بیماری مزمن کبدی با علت ناشناخته، آنتی بادی بر علیه ویروس هپاتیت C و همچنین ژنوم ویروس هپاتیت C قابل شناسائی نیست. در صورتیکه در کبد این بیماران ژنوم این ویروس قابل ردیابی بوده که به این حالت عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C گفته می شود. در این موارد کبد دچار آسیب می شود و به سمت فیبروز و سیروز می رود.
وی ادامه داد: با توجه به فقدان مارکرهای تشخیصی ویروس هپاتیت C در سرم این افراد، ابتلا به عفونت با روشهای روتین آزمایشگاهی قابل شناسایی نبوده و استاندارد طلایی برای تشخیص بیماران مبتلا به عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C، ردیابی ژنوم ویروس هپاتیت C در بیوپسی کبد است.
این محقق ایرانی در ادامه به نتایج و مزایای این طرح تحقیقاتی گفت: با انجام روش فوق می توان بدون نیاز به انجام بیوپسی کبد که روشی تهاجمی است و در بسیاری از موارد بیمار اندیکاسیون انجام آنرا نیز ندارد ( به طور مثال بیماران مبتلا به سیروز کبدی که دارای پلاکت پایینی هستند و ... ممکن است در اثر انجام بیوپسی دچار خونریزی شدید غیر قابل کنترلی شوند) و پزشک معالج صلاح نمی داند که بیوپسی کبد انجام شود، با گرفتن خون و جداسازی سلولهای تک هسته ای خون محیطی با استفاده از فایکول (روش گرادیانت غلظتی) و انجام آزمایش RT-nested PCR روی آن، عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C را شناسائی کرد.
وی خاطر نشان کرد: بنابراین با مشخص شدن علت بیماری مزمن کبدی، دیگر نیازی به انجام آزمایشات پرهزینه و ملال آور نیست زیرا وقتی پزشک علت بیماری مزمن کبدی فرد را نمی داند او را جهت مشخص شدن علت بیماریش بار ها و بارها برای انجام آزمایشات گوناگون به آزمایشگاه، انجام آندوسکوپی، .بیوپسی کبد، سونوگرافی ، سی تی اسکن و ... ارجاع می کند.
این متخصص ویروس شناسی در تشریح روند این طرح مطالعاتی گفت: در این روش پس از ردیابی ژنوم ویروس هپاتیت C در سلولهای تک هسته ای خون محیطی افراد مبتلا، محصول حاصل از آزمایش RT-nested PCR پس از کلون کردن در وکتور تعیین توالی و سپس توالی مذکور با استفاده از نرم افزار Chromas، در کامپیوتر باز شد و سپس با استفاده نرم افزارهای DNAman و یا  Megalin با سکانس های مرجع موجود در بانک ژن جهانی مقایسه شد و مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت و سپس درخت فیلوژنیک آن ترسیم شد.
دکتر بخارایی با تأکید بر اهمیت این روش گفت: با انجام این تکنیک می توان این عفونت را در درصد بالائی از موارد (70 تا 57 درصد)، بدون نیاز به انجام بیوپسی کبد ردیابی کرد و در صورتی که انجام بیوپسی کبد امکان پذیر باشد می توان در 100 درصد موارد آنرا شناسائی نمود.
وی با بیان این که این آزمایش برای شناسائی عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C در بیماران مبتلا به بیماری مزمن کبدی با علت ناشناخته (کریپتوژنیک) انجام شد، گفت: این آزمایش در مبتلایان به بیماری سیروز کبدی با علت ناشناخته (سیروز کریپتوژنیک)، هپاتوسلولار کارسینوما با علت ناشناخته، اختلالات لنفوپرولیفراتیو با علت ناشناخته، بیماران مبتلا به هموفیلی یا تالاسمی و یا بیماران همودیالیزی که از نظر عفونت هپاتیت C منفی هستند ولی در طول زندگی خون انتقال خون داشته اند و همچنین در اهدا کنندگان عضو یا ارگان و یا مغز استخوان قابل انجام و کاربردی است.
این محقق دانشگاه علوم پزشکی تهران ادامه داد: در مطالعه حاضر، پس از انجام آزمایش RT-nested PCR روی نمونه های بالینی بیماران، مشخص شد که از 69 بیمار مورد بررسی، 7 بیمار ( 1/10 % ) دچار عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C هستند، به این ترتیب که پلاسمای این بیماران از نظر آنتی بادی بر علیه ویروس هپاتیت C و ژنوم ویروس هپاتیت C منفی بود، در صورتیکه درسلولهای تک هسته ای خون محیطی این بیماران ژنوم ویروس هپاتیت C با روش مذکور شناسائی شد.
وی افزود: برای اطمینان از نتایج حاصل مجددأ نمونه های پلاسما و سلولهای تک هسته ای خون محیطی بیماران مذکور از نظر حضور ژنوم ویروس هپاتیت C با روش RT-nested PCR با استفاده ازپرایمر های اختصاصی دیگر برای ناحیه حفاظت شده UTR-′5 ژنوم ویروس هپاتیت C، مورد آزمایش قرار گرفتند و پس از تأئید نتایج مثبت، ژنوتیپ ویروس هپاتیت C با روش RFLP در این نمونه ها مشخص گردید. از بیماران مورد مطالعه در صورت مثبت شدن نتیجه آزمایش در سلولهای تک هسته ای خون محیطی، 2 بار دیگر به فاصله حدود 3 ماه نمونه گیری به عمل آمد وآزمایشات فوق تکرار شد و نتایج حاصل مورد تأئید قرار گرفت.
وی گفت: طی بررسی ابتدا از روش RFLP برای تعیین نوع ژنوتیپ ویروس هپاتیت C استفاده و سپس برای تأئید نهایی نوع ژنوتیپ این ویروس، آزمایش RT-nested PCR مجددأ روی نمونه های اخذ شده صورت پذیرفت پس از انجام آزمایش، محصول حاصل از مرحله دوم PCR در وکتور pJET1.2/blunt cloning vector،کلون و سپس تعیین توالی گردد.
دکتر بخارایی ادامه داد: نتایج حاصل از تعیین توالی در این مرحله در مقایسه با توالی های مرجع موجود ویروس هپاتیت C در بانک ژن جهانی، با هم مقایسه شدند و سپس با استفاده از سکانس های مرجع ویروس هپاتیت C که به صورت Online در دسترس می باشد، درخت فیلوژنیک آنها با استفاده از نرم افزار 4MEGA رسم شد و سپس توالی های مزبور در بانک ژن جهانی به نام ایران ثبت شد.
این متخصص ویروس شناسی خاطر نشان کرد: گزارشات اولیه از تعیین نوع ژنوتیپ ویروس هپاتیت C جدا شده از بیماران مبتلا به عفونت مخفی با ویروس هپاتیت C در اسپانیا، مبنی بر جدا شدن ژنوتیپ 1b ویروس هپاتیت C از نمونه بیوپسی کبد بیماران مبتلا به بیماری مزمن کبدی با علت ناشناخته بود، در صورتیکه نوع ژنوتایپ های ویروس هپاتیت C جدا شده از ایران (1a, 1b, 3a) با نوع ژنوتایپ جدا شده برای اولین بار در دنیا متفاوت بود که احتمالأ به علت نوع ژنوتایپ های این ویروس در کشور ایران می باشد.